بعد عزل الجين بأية طريقة كانت، لابد من معرفة التسلسل الكامل للجين في حالة توفر معلومات محدودة عنه. وكما بينا، في حالة معرفة تسلسل الأحماض الأمينية للناتج الجيني، فلا بد من تحليل القطعة النهائية للجين المعزول. وبعد كل هذا، فمن الضروري تأكيد أن الجين المعزول يمتلك التسلسل المتوقع. علاوة على ذلك، يجب معرفة تسلسل النهاية 5' وذلك للتشييد الجيني الدقيق ولغرس الجين في ناقل جيني ملائم. ولأجل معرفة تسلسل الجين أو قطعة الـ DNA المطلوبة فيجب تحويلها الى الشكل المفرد الشريط (ssDNA) ، ويتم ذلك بواسطة ربطها بنواقل جينية خاصة تتحرر من الخلية المضيف بصورة مفردة الشريط ناقلة لقطعة الـ DNA المرغوبة معها بهذه الهيئة أيضاً، تعرف تلك النواقل بــ M13 vectors. وتعتبر طريقة انهاء السلسلة منقوصة الأوكسجين المزدوجة (dideoxy chain termination method) أو طريقة Sanger و Coulson هي الطريقة الأكثر استخداماً لهذا الغرض. لقد قاما بابتكار ذاك البروتوكول في منتصف السبعينيات من القرن المنصرم. وهنالك طريقة أخرى لمعرفة تسلسل الـ DNA تعرف بالطريقة الكيميائية أو طريقة Maxam و Gilbert ولكنها أقل استخداماً بكثير من الطريقة الأولى، لذا سنقتصر في مناقشتنا على الطريقة الأولى فقط. تبدأ الطريقة بتخليق الشريط المكمل لشريط الـ DNA المفرد باستخدام قطعة كلينو ( Klenow fragment) التابعة لانزيم DNA plolymerase I من بكتريا القولون (أو باستخدام الانزيم المحور T7 DNA polymerase) وخليط من النيوكليوسيدات ثلاثية الفوسفات dATP, dTTP, dGTP, dCTP) dNTPS). ويستعمل بادئ خاص لهذه العملية يرتبط في الناقل M13 بالطبع في منطقة قبل (upstream) منطقة انحشار قطعة الـ DNA المراد معرفة تسلسلها. وعند بدء التخليق، تضاف النيو كلويتيدات ثلاثية الفوسفات في تسلسل مكمل للـ DNA المراد معرفة تسلسله. وعلى أية حال، اذا أضيفت ddNTP أو نيو كلويسيدة ثلاثية الفوسفات ذات سكر خماسي منقوص الأوكسجين في الذرتين 2' و 3' 2',3'-dideoxyribonucleoside triphosphate)) (سواء أكانت ddATP أو ddTTP أو ddGTP أو ddCTP) والتي تفتقد لمجموعة الهيدروكسيل الحرة في ذرة الكاربون 3' في خليط التفاعل، تنتهي البلمرة اذا تم اندماج ddNTP بدلاً من dNTP في أي وقت خلال عملية التخليق تلك ( شكل 1 )

شكل (1) مخطط يوضح طريقة انتهاء السلسلة (طريقة سانكر) في معرفة تسلسل الـDNA. لاحظ ان الحزم الموجودة في أعلى الهلام تمثل النهاية 5' . وهكذا تمثل الحزم الموجودة في أسفل الهلام النهاية 3' (تصميم المؤلف).

في تخليق الـ DNA، تحدث بلمرة أشرطة الـ DNA بسرع مختلفة وبالنتيجة، ينتج خليط غير متجانس من أشرطة الـ DNA وبأطوال متعددة والتي تمثل لكل التسلسلات المتوقعة اعتماداً على أي ddNTP مستخدمة في أنبوب التفاعل، تكون نيوكليويدة الانهاء أما A أو T أو C أو C وفي الحقيقة، تحدث كل التفاعلات الأربع بشكل منفصل عن بعضها مولدة أربع مجاميع من التسلسلات حيث تنتهي مجموعة كاملة بالـ ddATP ومجموعة بالـ ddCTP ومجموعة بالـ ddGTP ومجموعة بالـ ddTTP.

يمكن فصل قطع الـ DNA في كل مجموعة في الترحيل الكهربائي في هلام متعدد الأكريلامايد. وعلى أية حال، لابد من كشف الحزم المفصولة. وهنالك طريقة بسيطة للقيام بذلك وهو استخدام التوسيم الاشعاعي وذلك عن طريق انحشار النيوكلويتيدات الموسومة اشعاعياً"، كما في dATP الموسوم اشعاعياً بالفسفور (α³³P]dATP]) في مزيج التفاعل، وبالتالي كل القطع تكون موسومة اشعاعياً. ومن ثم يصار الى كشف الحزم المفصولة بالتصوير الاشعاعي الذاتي بالأشعة السينية.

يتم قراءة الحزم من الأسفل الى الأعلى أي بالاتجاه من 5' الى 3'. وعادة تكون الحزم في الأسفل باهتة جداً والحزم في الأعلى مضغوطة جدا على القراءة. وهنالك عدد محدود فقط من الحزم ) حوالي 200 قاعدة) والتي يمكن أن يتم قرائتها بسهولة. ولكي نحدد التسلسل الكلي للجين يجب تكرار هذا الاجراء لعدة مرات بتحريك موقع ارتباط البادئ على طول التسلسل. وفي العقد الأخير، تمت الاستعاضة عن هذه الاجراءات الروتينية لمعرفة التسلسل بشكل كبير باجراءات آلية (automated sequencing)  .ويتمثل التغيير الكبير في هذا البروتوكول استخدام الواسمات المتفلورة fluorescent  labels) ) بدلا من الواسمات الاشعاعية. (radiolabels) وقد تم استخدام أربع صبغات متفلورة، كل واحدة تمثل أحد الـ dNTPs .فالسلسلة المنتهية بالأدنين توسم بصبغة متفلورة معينة، والسلسلة المنتهية بالثايمين توسم بصبغة ثانية والسلسلة المنتهية بالكوانين توسم بصبغة ثالثة، والسلسلة المنتهية بالسايتوسين توسم بصبغة رابعة . وهكذا، وعند استخدام أربع واسمات متفلورة، أصبح من المنطقي انجاز أربع تفاعلات تسلسلية كما في البروتوكول اليدوي في مسار واحد في أنبوب منفرد ،وتحميل مزيج التفاعل هذا في مسار واحد في هلام متعدد الأكريلامايد. ويقوم كاشف التفلور المزودج مع جهاز قراءة التسلسل الآلي بمسح الحزم المفصولة، بحيث يميز بين الواسمات المتفلورة الأربع، ويترجم النتائج الى كروماتوغرام يمكن قراءته يتألف من قمم (peaks) متميزة عن بعضها البعض لونياً : فمثلا الأخضر للسايتوسين، والأحمر للكوانين، والبرتقالي للأدنين، والأزرق للثايمين (شكل 2).

شكل (2) : قراءة التسلسل المتولد بواسطة بروتوكول انهاء السلسلة ل Sanger و Coulson بطريقة آلية تعتمد على الصبغات المتفلورة. يتم توسیم كل ddNTP بصبغة متفلورة ذات لون مميز، بحيث يتم تشخيص نوع السلسلة المنتهية وذلك بامرارها على كاشف التفلور لينطبع التسلسل بطريقة آلية معتمد على التفلور (تصميم المؤلف).

ان بروتوكول معرفة التسلسل الآلي في المختبر الاعتيادي يمكن له أن يقرأ أكثر من 600 زوج قاعدي في ترحيل واحد. هذا وصممت أنظمة قراءة تسلسل الـ DNA الحديثة لتوليد أكثر من نصف مليون قاعدة نتروجينية في اليوم الواحد باستخدام هلام التسلسل المحتوى في عدة أنابيب شعرية Capillary tubes)) بدلاً من النوع اللوحي ( slab format) المعتاد. ومن الجدير بالذكر أن تحضير وتحميل العينات في الهلام الشعري يتم بصورة آلية من قبل "روبوت" بينما يتم تحليل النتائج آلياً أيضاً بنفس الطريقة.

على الرغم من التحويرات الكثيرة الحاصلة في معرفة التسلسل النيوكليوتيدي للأحماض النووية، الا أنها تستند على نفس المبادئ التي ابكترها Sanger. ولكن في الآونة الأخيرة برزت طريقة لتحليل تسلسل الـ DNA ، تمتاز هذه الطريقة بطاقة انتاجية عالية الا أنها لا تعتمد على مبادئ Sanger في تحليل تسلسل الـ DNA وتدعى بالـ pryosequencing وتسمح هذه الطريقة بتحليل سريع لتسلسل الجينوم كاملا، وسميت هذه الطريقة بهذا الاسم استناداً الى تحرر مركب الـ pyrophosphate ، والذي يتحرر في كل مرة تضاف فيها نيوكليوتيدة الى سلسلة الـ DNA النامية . وتستثمر هذه الطريقة تحرر الـ pyrophosphate كعلامة لاضافة نيوكليوتيدة الى سلسلة الـ DNA النامية، ويتوقع أن يزداد شيوع استخدام هذه الطريقة في المستقبل القريب

مواضيع ذات صلة

The Alpha Helix, Beta Sheet, and Beta Turn

Structures within Proteins

تصميم البوادئ primer design

Control of Gene Function and Biochemical Activity in Cells

آليات إصلاح الحمض النووي المتضرر DNA repair mechanisms

Hydrophobic Forces

Hydrogen Bonds and the Chelate Effect

Genes in the Cell Nucleus Control Protein Synthesis

RNA Proofreading

Regulation of Transcription by DNA Modification

Electrostatic Forces that Determine Protein Structure

A peptide bond